As bases nitrogenadas adenina, guanina e citosina são encontradas tanto nos nucleotídeos do DNA quanto do RNA; entretanto, a timina só é encontrada em DNA, e a uracila, apenas no RNA. Veja o quadro a seguir, que resume a composição dos nucleotídeos do DNA e do RNA:

Formação da molécula de DNA

A molécula de DNA é formada por uma estrutura em dupla hélice, composta por duas cadeias nucleotídicas, que são organizadas em forma helicoidal e mantidas unidas por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas das duas cadeias.

Essas duas cadeias que compõem a dupla hélice são complementares, ou seja, quando se tem presente uma adenina, na mesma posição da outra cadeia terá uma timina, e vice-versa. Quando se tem presente uma guanina, terá na outra cadeia, na mesma posição, uma citosina, e vice-versa. É importante lembrar que não existe uracila no DNA, apenas no RNA. Dentre essas bases nitrogenadas, os pares são unidos por ligações de hidrogênio: a adenina e a timina formam duas ligações entre si, enquanto a guanina e a citosina formam três ligações.

Como vimos, para a formação da molécula de DNA, é necessária a união entre os nucleotídeos através de ligações covalentes, que ocorrem da seguinte maneira: o grupo hidroxila do carbono-3 da pentose, pertencente ao primeiro nucleotídeo, liga-se ao grupo fosfato, que se encontra ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose do segundo nucleotídeo, através de ligações fosfodiéster.

Devido a esses fatores, a formação do DNA é direcionada sempre na direção de 5’=3’, já que, em um lado, temos disponível a hidroxila do carbono-5 da primeira pentose, e, na outra extremidade, temos livre a hidroxila do carbono-3 da última pentose.

Replicação do DNA

Este processo se inicia através da enzima helicase, que é responsável pela separação das duas cadeias de DNA, ou seja, promove o rompimento da dupla hélice, formando duas fitas simples de DNA. Em seguida, a enzima DNA-polimerase usa as cadeias separadas como molde, pois, com os nucleotídeos dos filamentos expostos, são adicionados nucleotídeos complementares a cada umas dessas duas fitas, resultando em um novo filamento complementar. Com isso, ao final desse processo, temos dois novos exemplares, e cada dupla hélice filha possui um filamento intacto do seu genitor.

Como vimos anteriormente, a síntese de DNA sempre ocorre na direção 5’=3’, porque a enzima DNA-polimerase age apenas em hidroxila de extremidade 3’ livre, iniciando o processo de adicionar os nucleotídeos por essa extremidade. Portanto, a forma de complementar o segundo filamento ocorre de maneira diferente, de modo oposto e descontinuamente. Então, enquanto a fita principal é sintetizada de forma contínua e “para a frente”, a fita tardia é sintetizada a partir de fragmentos curtos e em sentido contrário à fita principal, existindo lacunas, que posteriormente são ligadas a fragmentos de Okazaki, e é catalisada pela enzima DNA ligase. Isso transforma a fita tardia em uma fita contínua.

A transcrição tem a participação da enzima RNA-polimerase, que se fixa na região promotora de uma das fitas de DNA (filamento molde), no trecho com o gene a ser transcrito, para dar início à produção do filamento de RNA, promovendo o pareamento de bases. Assim como o DNA, o filamento de RNA também é formado na direção 5’ = 3’; entretanto, no lugar da base timina, o RNA terá uracila, e o açúcar será a ribose. Quando a RNA-polimerase termina a transcrição, chegando ao fim do gene, recebe um “sinal” e se separa do DNA. Diferentemente do DNA, o RNA possui apenas um filamento, e seu tamanho varia de acordo com a proteína que este produzirá.

Esse filamento recém-montado recebe o nome de RNA transcrito primário do gene, que é processado e acaba deixando o núcleo, migrando para o citoplasma. Lá, participará da síntese de proteínas, como RNAm, em processo que chamamos de tradução.

Tradução

A tradução é o processo no qual ocorre a síntese de proteínas, com a participação conjunta principal do RNAm, o RNAt e de estruturas celulares denominadas ribossomos.

A tradução tem início através do códon de iniciação AUG, referente ao aminoácido metionina (Met). É importante levar em consideração que a Met sempre será o aminoácido que dará início à tradução, mas não é sempre o primeiro aminoácido da cadeia proteica, já que muitas vezes a Met é retirada após a tradução.

Com o complexo de iniciação formado sobre o RNAm, acontece a ligação da subunidade grande ribossomal, com três locais onde a molécula de RNAt pode se ligar. Com isso, tem início a fase que é denominada de alongamento, e, nela, o RNAt, trazendo o aminoácido correspondente ao códon seguinte da cadeia, liga-se ao ribossomo, enquanto o RNAt de Met é liberado para o citoplasma. Na sequência, ligações peptídicas são realizadas e se repetem até que todos os códons presentes na molécula de RNAm sejam “lidos” pelos RNAt, com a adição dos novos aminoácidos. Ocorre, então, o crescimento da cadeia, por isso o nome fase de alongamento, e esta se estende até que chegue a um dos códigos de terminação, que podem ser UAA, UAC, UGA. Esses códons não codificam aminoácidos nem fazem ligação com nenhum RNAt; em vez disso, eles possuem estrutura para se ligarem a fatores de liberação de proteínas, fazendo com que a proteína recém-formada seja considerada completa e se separe do ribossomo.

Código genético

O código genético relaciona a sequência dos nucleotídeos que constituem o DNA, a sequência de códons do RNAm e os aminoácidos que constituem as proteínas sintetizadas, facilitando, dessa forma, o entendimento das funções biológicas ligadas a eles. Foi elaborado através de combinações dos 4 nucleotídeos do RNAm, em grupos triplos, obtendo-se 64 combinações, que codificam aminoácidos. Porém, atualmente, temos conhecimento de apenas 20 aminoácidos, o que nos leva a concluir que existe mais de um códon para o mesmo aminoácido. Em função disso, o código genético é intitulado como degenerado.

Profissionais da saúde usam o conhecimento acumulado sobre as características do DNA e realizam uma série de técnicas com finalidades diferentes, assim como também abrangem áreas que nem sempre estão relacionadas à saúde humana.

Aplicações das análises de DNA

Atualmente, com o conhecimento adquirido sobre as características do DNA, suas funcionalidades e regulações, empregamos essas descobertas através de diversas técnicas de análises moleculares, em diferentes áreas do conhecimento, como: saúde, justiça, agronomia, pecuária, farmácia, nutrição. A seguir, estudaremos exemplos de como essas análises são utilizadas na prática e de que forma contribuem para a solução de diferentes problemas.

Aconselhamento genético (risco)

Pessoas que possuem casos de doenças genéticas na família são aconselhadas a fazer um exame para saber se também possuem o gene associado à doença em questão, indicando uma predisposição genética para o desenvolvimento da enfermidade futuramente. Sendo assim, esse é outro campo em que a engenharia genética, com seus avanços na área molecular, favoreceu-nos para desenvolver análises da presença ou ausência de determinados genes que indicam a predisposição para determinadas doenças.

Diagnóstico de doenças genéticas

Quando existe uma suspeita de que um indivíduo possua uma doença genética, podemos confirmar ou descartar o diagnóstico através da análise do material genético da pessoa.

Sim, porém essa identificação é realizada através de testes que são feitos durante o período da gestação, no pré-natal. Nesse caso, é retirada uma amostra do líquido amniótico, que é analisada para a detecção de possíveis alterações genéticas no feto em formação.

Tipos de sequenciamentos

Há quatro tipos de sequenciamento, a saber:

Projeto Genoma atualmente mundialmente

Sabemos que inicialmente os desafios tecnológicos enfrentados para que o Projeto Genoma pudesse dar continuidade foram grandes, devido à utilização de metodologias que necessitam de bastante tempo para sua finalização de forma eficiente. As dificuldades na época inicial do Projeto Genoma de compartilhamento de informações resultaram em análises superficiais naquele momento.

Durante o início, os estudos do sequenciamento dos genes eram baseados na análise dos fragmentos de DNA através do método de eletroforese com gel de poliacrilamida. Porém, houve um avanço que agilizou os estudos, adiantando os resultados antes do esperado, quando foi introduzido o Sequenciamento Sanger. Este permitiu um sequenciamento muito mais rápido e, assim, em 2003, tivemos o evento que ficou conhecido como o “final do início” ao anúncio da conclusão do sequenciamento.

Princípio da tecnologia do DNA recombinante – um breve histórico

Você pode estar se perguntando no que, de fato, consiste esse princípio tão importante. Essa tecnologia consiste, resumidamente, em processos de transferência de DNA de um organismo para outro com o objetivo de gerar melhorias com a modificação e tem como técnica central a clonagem molecular. O termo DNA recombinante diz respeito a como nos referimos às moléculas de DNA que possuem tais alterações, ou seja, seu material genético é derivado de duas ou mais fontes, que muitas vezes são misturas de diferentes espécies.

Clonagem

Clonagem é o nome dado ao processo científico pelo qual é produzida uma cópia idêntica geneticamente a um molde. A clonagem pode ocorrer em nível molecular, celular ou mesmo de organismos. Em nível celular, uma célula geneticamente idêntica é criada a partir de uma célula molde, resultando em duas células idênticas, uma original e um clone. Em organismos, é realizada in vitro, onde é formado um indivíduo sem a fusão de gametas. Em nível molecular, a clonagem do DNA é o principal processo da tecnologia do DNA recombinante.

Como ocorre a clonagem do DNA?

Em primeiro lugar, é preciso definir o gene ou segmento do DNA que deverá ser clonado. O processo tem a participação de dois tipos de enzimas: as enzimas de restrição e a enzima DNA ligase. Utilizamos a primeira para realizar a separação do gene ou fragmento de DNA desejado, ou seja, essa enzima tem a capacidade de cortar a molécula de DNA em locais específicos, obtendo-se o gene ou o fragmento de interesse. Esse gene será posteriormente colocado em um vetor, que consiste em uma molécula de DNA que tenha a capacidade de transportar esse fragmento de DNA para dentro de uma célula.

A imagem a seguir ilustra o processo de clonagem por meio de bacteriófagos.

Para que este fragmento de DNA seja incorporado ao vetor, é necessária a atuação da mesma enzima de restrição que o separou de sua célula de origem. Após este processo, os dois segmentos de DNA podem ser incorporados através da enzima DNA ligase, formando finalmente a molécula de DNA recombinante.

Com a formação dessa nova molécula estável, o vetor pode ser introduzido em uma célula, geralmente célula bacteriana. Após sucessivas divisões das células, é feita a identificação e a separação delas, agora denominadas recombinantes, e passadas às células ou ao organismo-alvo; assim, a porção de DNA desejada é passada para este organismo, e este a incorpora. Após receber o fragmento de DNA, o organismo-alvo passa a possuir aquele gene de interesse, fazendo parte de seu material genético.

A partir da obtenção das células recombinantes, muitas aplicações são possíveis, como veremos mais adiante.

Os transgênicos, ou OGM, como o nome já diz, são aqueles organismos que sofreram alteração genética, ou seja, que receberam um gene de outro organismo, que atuou como doador. Esse gene recebido se integrou ao código genético do receptor, gerando uma mudança através de uma característica que o receptor não apresentava anteriormente.

Na natureza, tal evento reproduzido em laboratório ocorre de forma natural, através de mutações ou alterações que acontecem espontaneamente. Porém, no caso de OMG, a alteração é precisamente manipulada por cientistas em busca de alguma mudança benéfica e, após esse processo, são realizados estudos para averiguar se o novo organismo gerado é equivalente ou não ao produto de origem.

A engenharia genética permitiu que os cientistas modificassem o código genético de organismos, reproduzindo eventos que ocorrem espontaneamente na natureza de forma proposital em laboratório.

Podemos dizer que os cientistas enxergaram na engenharia genética a possibilidade para a solução de problemas da sociedade. Eles utilizaram conceitos já existentes na natureza, como dito anteriormente; logo, as técnicas não foram projetadas por seres humanos: são fruto da observação de outros seres, que possuem a habilidade de transferir características genéticas para outros organismos de outras espécies, de forma natural.

Levando em consideração tais informações, os OGMs são produtos da ideia de aprimorar alguns organismos, com o objetivo de amplificar habilidades, gerando vantagens evolutivas.

O T-DNA também possui regiões que codificam enzimas que determinam a síntese de opinas, catalisadas especificamente pela bactéria colonizadora, servindo como nutriente.

Exatamente pela sua capacidade de transferência de gene. Essa característica da bactéria está sendo explorada em processos biotecnológicos, já que os genes que formam o T-DNA podem ser facilmente substituídos por outros genes de interesse, como os que expressam resistência a um antibiótico, por exemplo.

A transformação genética usando a Agrobacterium tumefaciens como vetor tem sido empregada em plantas, mas há pesquisas usando essa bactéria em outros organismos, como fungos, animais e até células humanas. Portanto, pode-se concluir que a transformação genética de plantas por meio da Agrobacterium tumefaciens é possível devido ao conhecimento prévio das bases moleculares responsáveis pelo processo de infecção da planta hospedeira, servindo como um vetor natural para a transformação genética em plantas e em outros organismos.

Manipulação do genoma por microinjeções pronuclear

Essa técnica é realizada, como o nome já diz, através de microinjeções contento uma solução com transgene de interesse em sua composição, no pronúcleo de um óvulo recém-fertilizado. Dessa forma, cópias dos genes injetados se integram ao DNA do indivíduo hospedeiro e se distribuem de forma mendeliana, em sítios aleatórios no genoma.

Por isso, o transgene deve conter todos os elementos de um gene natural, ou seja, a região promotora, a região codificante e o sítio de adição de poli-A, que são constituídos pela técnica de DNA recombinante, programados para responderem a estímulos biológicos.

Sendo assim, esse gene exógeno inserido, uma vez integrado ao DNA do indivíduo receptor, passa a se superexpressar nos tecidos de interesse, tornando possível o estudo da função daquele gene no organismo.

Essa combinação gerou uma nova forma de criação de transgenia, mais precisa na manipulação do genoma, gerando um indivíduo geneticamente mais consistente.

Essa técnica consiste em algumas etapas, a saber: